細(xì)胞/ 組織總RNA 提取試劑盒

FastPure^® Cell/Tissue Total RNA Isolation Kit

細(xì)胞/ 組織總RNA 提取試劑盒

純度高: 獲得的RNA純度高，可直接用于下游純度要求高的實(shí)驗(yàn)。

基因組殘留少: 配有基因組DNA吸附柱和DNase膜上消化模塊，可有效去除DNA污染。

簡單快速: 無需配備其他試劑、無需酚氯FANG抽提、常溫操作即可。

通用性強(qiáng): 適用于多種不同類型的細(xì)胞、組織RNA的提取。

分別使用Vazyme #RC101和T公司同類試劑提取2 × 10⁶ 個(gè)293T細(xì)胞總RNA，使用100 μl洗脫體積，取1 ul提取產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。從圖中可以看出，Vazyme #RC101提取RNA濃度高于T公司同類產(chǎn)品。

本試劑盒可從動(dòng)物細(xì)胞或組織中快速提取總RNA。試劑盒基于硅膠柱純化技術(shù)，提取過程中無需使用有毒的酚/ 氯FANG抽提，全程僅需30 min。試劑盒中g(shù)DNA-Filter Columns能夠有效的分離上清和組織裂解物并吸附去除gDNA，另外，試劑盒中配有DNase膜上消化模塊，可有效去除DNA 污染；RNAPure Columns能高效的結(jié)合RNA，配以優(yōu)化后的Buffer溶液，使得到的總RNA純度高，無蛋白和其他雜質(zhì)污染，可用于RT-PCR、Real-time PCR、芯片分析等多種下游實(shí)驗(yàn)。

DNase I置于-20℃保存；

Buffer RL1在加入β-巰基乙醇后，可在4℃保存1個(gè)月；

其余組分均可在常溫(15-25℃)干燥條件下保存。

細(xì)胞/ 組織總RNA 提取試劑盒

Q1：RNA提取得率低。

A1：(1) 樣本保存不當(dāng)或者樣本保存時(shí)間過久。樣本保存不當(dāng)或者保存時(shí)間過長都有可能導(dǎo)致RNA的降解，采集新鮮樣本或經(jīng)過液氮速凍后保存于-70℃或液氮中的樣本。

(2) 勻漿或者液氮研磨不充分。勻漿或者液氮研磨不充分，裂解不充分，導(dǎo)致RNA的釋放不充分。

(3) 組織或者細(xì)胞中RNA含量偏低：不同細(xì)胞和組織中 RNA 的豐度不同，需做預(yù)實(shí)驗(yàn)確定合適的樣品起始量。

(4) 組織起始量太少或者太多：樣品量過少，則細(xì)胞組織中RNA含量較低；樣品量過多則可能超過裂解液的裂解能力，裂解將不*，從而導(dǎo)致RNA得率低或質(zhì)量下降。

(5) 洗脫不充分。RNase-free ddH₂O滴加到純化柱膜中央。純化柱的洗脫體積為50-200 μl，若洗脫效果不理想，可以加入在65℃預(yù)熱的RNase-free ddH₂O后，延長室溫放置時(shí)間，離心后進(jìn)行第二次洗脫。

Q2：gDNA-Filter Columns堵塞問題。

A2：(1) 樣品用量太多。本試劑盒適用于提取10-20 mg動(dòng)物組織或者2-5×10⁶個(gè)細(xì)胞，超量的組織會(huì)降低產(chǎn)量以及純度，操作時(shí)應(yīng)減少樣本使用量。

(2) 樣品富含肌纖維。肌肉、心臟以及皮膚等富含肌纖維，肌纖維的分子量大，會(huì)引起柱子堵塞，樣本處理時(shí)采用液氮研磨方式會(huì)降低堵柱現(xiàn)象。

(3) 組織研磨或者勻漿不充分。研磨或者勻漿不充分時(shí)，碎片有可能導(dǎo)致柱堵塞，將裂解后的液體先進(jìn)行 13,000×g 離心5 min，取上清再加入gDNA-Filter Columns。

Q3：RNA降解。

A3：純化后的RNA降解與樣本質(zhì)量、是否被RNase污染、操作方式等因素有關(guān)：

(1) 樣本因?yàn)闆]有及時(shí)保存，導(dǎo)致RNA降解。組織樣本或者細(xì)胞在收集后若不及時(shí)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，液氮速凍后于-80℃保存。

(2) 樣本反復(fù)凍融。組織樣本保存時(shí)，分小塊保存，避免因反復(fù)凍融導(dǎo)致樣本降解。

(3) 電泳原因。常見的RNA降解現(xiàn)象部分因?yàn)殡娪具^程引起的，電泳前將電泳槽用3％雙氧水浸泡20 min，之后用RNase-free ddH₂O進(jìn)行沖洗，電泳緩沖液用RNase-free ddH₂O配置。

(4) 確保提取過程中使用的槍頭和離心管均為RNase-free。

Q4：提取的RNA有基因組DNA污染。

A4：不同種類組織細(xì)胞DNA、RNA含量相差很大，請(qǐng)勿超過20 mg組織和5×10⁶細(xì)胞。如肝臟、脾臟和腎臟DNA含量豐富，請(qǐng)勿超過10 mg，否則會(huì)導(dǎo)致基因組殘留過多。gDNA-Filter Columns能夠有效去除體系中大部分DNA，如果下游實(shí)驗(yàn)對(duì)微量DNA十分敏感，可根據(jù)具體情況選擇選擇使用以下方案：

(1) 使用試劑盒提供的DNase I進(jìn)行膜上消化清除DNA污染。

(2) 設(shè)計(jì)引物時(shí)選用跨內(nèi)含子的引物，從而避免基因組DNA模板參與擴(kuò)增反應(yīng)。

(3) 逆轉(zhuǎn)錄時(shí)選擇含有基因組去除模塊的逆轉(zhuǎn)錄試劑。