人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞復(fù)蘇

從液氮中取出細(xì)胞凍存管，迅速放入37℃水浴中解凍至管內(nèi)殘留一點(diǎn)冰屑。用75%酒精擦拭凍存管后，將內(nèi)容物吸至一15ml無(wú)菌離心管中，逐滴加入預(yù)溫至37℃的RPMI-1640培液4-5ml混勻，室溫1500rpm離心10分鐘棄上清。再用RPMI-1640培液4-5ml洗滌一次，離心后棄上清，加HUVEC*培養(yǎng)液4-5ml備用，每支HUVEC凍存管含細(xì)胞量為5×10個(gè)。

細(xì)胞接種和培養(yǎng)

1、細(xì)胞接種:

(1)、包被液:用去離水配制0.5%明膠溶液，過(guò)濾除菌。

(2)、培養(yǎng)瓶包被:取2-4個(gè)T25培養(yǎng)瓶，每個(gè)培養(yǎng)瓶加2-3ml0.5%明膠溶液，搖勻使包被液布滿培養(yǎng)瓶底面，置37℃2小時(shí)或放置過(guò)夜。

(3)、接種細(xì)胞:接種前吸凈包被液，按2500-5000個(gè)細(xì)胞/cm接種細(xì)胞(1支5×10個(gè)細(xì)胞可接種2-4個(gè)培養(yǎng)瓶)，每瓶加培養(yǎng)液3-5ml,搖勻后置37℃5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24小時(shí)，此時(shí)細(xì)胞已*貼壁，更換培養(yǎng)液后繼續(xù)在37℃5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

(4)、擴(kuò)大培養(yǎng):一般每周更換培養(yǎng)液2次，至細(xì)胞長(zhǎng)至覆蓋培養(yǎng)面的70-80%可進(jìn)行傳代或凍存。

消化細(xì)胞

消化液:用pH7.0-7.2的PBS或D-Hank'S液，分別配制0.25%胰酶液和0.02%EDTA-Na2液，用前按1:1混合。在細(xì)胞傳代或凍存前先消化細(xì)胞。具體操作如下:吸凈培養(yǎng)液，每瓶加消化液1ml，搖勻使其布滿培養(yǎng)瓶細(xì)胞面。37℃消化2-5分鐘。顯微鏡下看細(xì)胞回縮成圓形后，輕輕震動(dòng)使絕大部細(xì)胞脫落后，每瓶加含10%FBS的RPMI-1640液的中和液4-5ml中和胰酶的消化作用，并用吸管輕輕吹打培養(yǎng)面使細(xì)胞*脫落后，吸至15ml無(wú)菌離心管內(nèi)。4℃1500rpm離心10分鐘棄上清，再用中和液洗滌細(xì)胞，離心棄上清，加適量RPMI-1640液，混勻后取10ul 細(xì)胞懸液加10ul臺(tái)盼藍(lán)混勻后作細(xì)胞計(jì)數(shù)，按需要做步驟四或五。

細(xì)胞傳代

方法同步驟二。

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞凍存

調(diào)整細(xì)胞數(shù)2-5×10個(gè)/ml，按含細(xì)胞的RPMI-1640液ml數(shù)，配制等量的凍存液。凍存液中FBS占80%，DMSO占20%。例:含細(xì)胞的RPMI-1640液為8ml，應(yīng)配凍存液8ml，其中FBS為6.4ml,DMSO為1.6ml，混勻。置細(xì)胞懸液于冰浴中，逐滴加入凍存液，邊加邊搖動(dòng)。加完后用吸管吹打混勻。于冰浴中分裝細(xì)胞于凍存管中，1.8ml/管，再將凍存管置于凍存盒內(nèi)置-80℃冰箱，24小時(shí)后轉(zhuǎn)入液氮中保存。