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將動物組織或細胞分散成單個細胞，在模擬機體內(nèi)的生長環(huán)境條件下，使其在體外環(huán)境繼續(xù)生長增殖的過程，稱為細胞培養(yǎng)。體外培養(yǎng)可分為原代培養(yǎng)（亦稱初代培養(yǎng)）和傳代培養(yǎng)（亦稱繼代培養(yǎng)）。原代培養(yǎng)是指將機體取出的組織或細胞進行初次培養(yǎng)的過程。初次培養(yǎng)的細胞大約增殖10代左右，這樣的細胞稱為原代細胞。從原代培養(yǎng)的細胞繼續(xù)轉(zhuǎn)接培養(yǎng)稱為傳代培養(yǎng)。在體外環(huán)境條件下持續(xù)傳代培養(yǎng)的細胞稱為傳代細胞。

（一）體外培養(yǎng)的細胞根據(jù)其生長方式

1．貼壁型依賴性細胞

生長時需要附著于某些帶適量正電荷的固體或半固體表面，大多數(shù)動物細胞體外培養(yǎng)時，均以此種方式生長。非淋巴組織的細胞、多種異倍體細胞也屬此種類型。

2．非貼壁依賴性細貼胞

此類細胞體外生長不必貼壁，可在培養(yǎng)基中懸浮生長，血液、淋巴組織細胞、腫瘤細胞、雜交瘤細胞、轉(zhuǎn)化細胞系等都屬此類細胞。原則上各種動物組織都可以進行體外培養(yǎng)。而實際上幼體組織比老齡組織更容易培養(yǎng)，尤其是胚胎組織。分化程度低的比分化程度高的容易培養(yǎng)；腫瘤組織比正常組織容易培養(yǎng)。任何動物細胞培養(yǎng)均須從從原代培養(yǎng)開始。

2.培養(yǎng)方法

（1）取材

首先要對所取動物組織的各種情況做詳細記錄。從動物體內(nèi)取材必須嚴格遵守無菌操作。所用器皿事前經(jīng)嚴格的消毒滅菌。采用各種適宜的方法處死動物，取出組織放入小燒杯中，用尖嘴眼科剪刀將組織塊剪碎成1mm3大小，用吸管吸取Hanks液沖下剪刀上的碎塊，補加3～5mL Hanks液，用吸管輕輕吹打，低速離心，棄去上清液，留下組織塊。也可用兩手術(shù)刀片將組織塊切碎，這樣對細胞損傷較小，但操作時間長，容易污染。對某些軟組織如腫瘤、胚胎、腦等可將碎組織塊放入注射器玻璃管中擠壓分離。也可用1mm、10μm、20μm三種規(guī)格的不銹鋼或尼龍網(wǎng)篩擠壓分離，但對較硬的組織和纖維組織效果不好。

（2）分離

組織消化法是用生物化學(xué)的方法將剪碎的組織塊分散成細胞團或單細胞。常用的消化液有：胰蛋白酶適用于細胞間質(zhì)較少的軟組織，如胚胎、羊膜、上皮、肝、腎以及傳代細胞等。

操作方法：

1）將剪碎的組織塊放入有玻璃珠的三角燒瓶種，加入30～50倍體積的0.25％胰蛋白酶；

2）37℃水浴內(nèi)消化30～60 min，每5～10 min搖動一次，根據(jù)效果可中間更換消化液，靜止10 min，吸去2/3清液。補加新鮮胰蛋白酶；

3）Hanks液漂洗兩次，每次2～3 min；

4）800r/min離心5 min，棄上清液，加入營養(yǎng)液，如有大塊，可用紗網(wǎng)過濾。如消化傳代細胞，可與EDTA混用。

膠原酶——這種用細菌提取的酶對膠原和細胞間質(zhì)有較強的消化作用。使用于消化纖維組織、上皮組織、癌組織等。此酶步受Ca2+、Mg2+的螯和作用，可用BBS和含血清培養(yǎng)基配制成濃度為200u/ml或0.1～0.3 mg/ml的溶液。其作用溫和，無須機械震蕩。

5）培養(yǎng)瓶中放入1～5 mm3大小的碎組織塊，加5 ml 2000u/mL的膠原酶溶液，使終濃度為200u/ml，pH6.5；

6）36℃水浴24～48 h，視情況可適當延長，無需震蕩，期間可更換酶液一次；

7）見組織塊已變軟，分散于瓶低，輕微震蕩即散成細胞團或單細胞，小心倒出培養(yǎng)液，瓶低可能附著一些巨噬細胞，借此可將其分開，單獨培養(yǎng)或棄之不用；

8）800r/min離心5 min，棄上清液，重懸于BBS液中，在重復(fù)離心一次；

9）加入培養(yǎng)液制成細胞懸液用于接種。

其他的酶如鏈酶蛋白酶、粘蛋白酶、蝸牛酶等也可用于培養(yǎng)細胞的消化。需根據(jù)酶的作用特點及組織成分的不同適當選用。EDTA最適用于消化傳代細胞，常與胰蛋白酶配合用，方法如前所述。

10）細胞計數(shù)

細胞懸液制成后，需要計數(shù)懸浮液中細胞的濃度，通常以“細胞個數(shù)/ml”表示。在培養(yǎng)貼壁細胞或懸浮細胞時也需要檢查培養(yǎng)液中的細胞濃度，檢查方法如下：

在干凈的離心管中加入9滴細胞懸液，在加入0.4%臺盼藍（錐蟲藍）1滴，混勻后靜置2～3 min；將計數(shù)板平放在顯微鏡臺上，在蓋片邊緣加入1～2滴染色的細胞懸液，使之完全充滿計數(shù)板與蓋玻片間的空間，勿留氣泡，勿使蓋片漂浮。

A. 在顯微鏡下記錄計數(shù)板四角四個大格中的細胞總數(shù)，原則是染藍的細胞不數(shù)（死細胞），無色的細胞計數(shù)（活細胞，壓線的細胞，數(shù)上不數(shù)下，數(shù)左不數(shù)右，一團細胞按一個細胞計數(shù)；

B. 按下列公式計算細胞懸浮濃度：

細胞懸液濃度（細胞個數(shù)/ml）=（4大格細胞總數(shù)/4）×104×稀釋倍數(shù)計數(shù)時要注意：如果細胞團數(shù)超過10%，說明消化過程進行得不充分；如果細胞數(shù)少于20個/mm3或多于50個/mm3說明稀釋不當，需重新操作。

（3）常用培養(yǎng)法

1）組織塊培養(yǎng)法

將組織塊剪切成小塊，直接放入培養(yǎng)瓶（皿）中，貼附一段時間后，細胞從組織塊長出，最終形成單層細胞。該法簡便，適合上皮細胞、骨骼肌細胞的原代培養(yǎng)，更適合組織量少的牙髓細胞原代培養(yǎng)（用蓋玻片條培養(yǎng)法）。

2）懸滴培養(yǎng)法

組織培養(yǎng)是Harrison（1907年）和Carrel（1912年）等首先發(fā)展建立的體外組織培養(yǎng)方法。他們在載玻片或蓋玻片上滴上血漿或淋巴液，將一小片組織埋于血漿或淋巴液中，加胚胎浸出液和血清，混合，血漿凝固固定組織塊，胚胎浸出液和血清提供營養(yǎng)，細胞從外植塊向四周遷移生長。懸滴培養(yǎng)法是最簡單和最原始的培養(yǎng)法。

將培養(yǎng)的組織剪成1 mm3的小塊為宜。圖中使用一片較大的方蓋片和一片小蓋片粘附在一起，是為了換液和傳代方便。加血漿，接種組織，再加胎汁使之與血漿充分混合。稍置片刻待血漿凝固，則組織小塊被凝固于血漿胎汁混合物中。然后取一凹玻片，四角涂凡士林少許，把蓋片反轉(zhuǎn)粘附在凹玻片上。隨后沿方蓋片四周涂融蠟封閉，勿使其漏氣，置于37℃溫箱培養(yǎng)。

此法細胞生長空間狹小、氣體不足，細胞不能持續(xù)長時間生長，培養(yǎng)基易液化，需要常更新培養(yǎng)基。其次是凹玻片折光，不便于直接觀察活細胞和攝影。

3）卡氏瓶培養(yǎng)法

為了擴大細胞生長面積和空間，Carrel設(shè)計了卡氏瓶培養(yǎng)，此法與雙蓋玻片法原理相似，不同的是組織塊被植入到特別的卡氏瓶中培養(yǎng)。細胞在卡氏瓶中，氣體充足，附著面寬闊，營養(yǎng)豐富，細胞能較好地生長，而且卡氏瓶適合觀察。操作方法是：

A．將組織剪切成細小碎塊后，用平衡鹽溶液漂洗。

B．組織碎塊轉(zhuǎn)移到第二只培養(yǎng)皿中，在解剖顯微鏡下，將不需要的組織諸如脂肪或壞死的材料，用外科手術(shù)刀交叉解剖掉，將組織塊切成約1mm3小塊。

C．用滴管將組織小塊移到消毒離心管或普通容器內(nèi)（注意吸管在吸組織小塊前，先用平衡鹽溶液弄濕內(nèi)表面，否則易粘著組織小塊）。靜置使組織小塊下沉。吸去上清液，換入新鮮平衡鹽溶液漂洗組織小塊，如此重復(fù)兩到三次。

D．將組織小塊轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)瓶內(nèi)，每只體積為25 ml的培養(yǎng)瓶內(nèi)可放置20～30塊組織小塊，吸去液體。在每只25 ml培養(yǎng)瓶內(nèi)加入1ml生長培養(yǎng)液，輕輕地傾斜擺動培養(yǎng)瓶。使組織小塊均勻地分布于生長瓶內(nèi)壁表面上。把瓶蓋蓋上，放入恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)或放入36.5℃暖房內(nèi)，靜置18～24 h。

E．待組織塊均已沾附玻壁上后，經(jīng)過3 ~5 d，在每只25 ml的培養(yǎng)瓶內(nèi)加5 ml培養(yǎng)液，然后每周更新培養(yǎng)液一次。培養(yǎng)3～5周，組織塊周圍的生長暈不斷地增長，當細胞從組織向四周伸展，細胞生長較多時用肉眼或低倍鏡下觀察猶如日暈，稱“生長暈”。

F．將生長暈中央的組織塊用外科小刀取出，用預(yù)先濕潤的滴管移到另一新的培養(yǎng)瓶中，從步驟④起重復(fù)操作。

G．在吸去組織塊的生長暈培養(yǎng)瓶內(nèi)，換入新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。待生長暈細胞擴展到蓋住培養(yǎng)瓶底約50%表面時，用來進行細胞培養(yǎng)。

4）單層細胞培養(yǎng)法

自20世紀50年代，細胞培養(yǎng)技術(shù)有兩個大的改進：一是在研究細胞代謝的基礎(chǔ)上開始應(yīng)用合成培養(yǎng)基，二是采用了胰酶消化分散細胞的技術(shù)，把組織團塊分散成較小的細胞團或單個細胞。采用這些措施的結(jié)果，細胞不僅在培養(yǎng)環(huán)境中長得更好，而且由于細胞生存在液體培養(yǎng)基中，無血漿支架，只能附在瓶壁上長成單層，形成所謂單層細胞培養(yǎng)。

單層細胞培養(yǎng)更進一步促進了組織培養(yǎng)法的發(fā)展。由于單層細胞便于傳代和觀察，從而演變出了建立長期傳代的細胞系和單細胞分離培養(yǎng)純細胞株的技術(shù)，使組織培養(yǎng)技術(shù)更趨完善。

單層細胞培養(yǎng)有下列幾點好處：
①更換新鮮培養(yǎng)液比較容易，可先用血清培養(yǎng)液培養(yǎng)，然后可方便地換為無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)，用于觀察某些因子加到培養(yǎng)液后的作用，以及從培養(yǎng)液中減去某些因子后對細胞生長的影響；
②如實驗要求細胞密度較高時，較容易采用灌注技術(shù)提供高密度細胞所需要的營養(yǎng)成分；
③當細胞粘附在基底質(zhì)上后，更容易表達某些產(chǎn)物；
④單層細胞培養(yǎng)更適用許多細胞系。

單層細胞培養(yǎng)法：取材后剪成1～3 mm3的小塊，經(jīng)過消化分離，細胞計數(shù)，分裝入培養(yǎng)瓶中保溫培養(yǎng)。

培養(yǎng)過程中隨著細胞的增長，尤其在細胞生長十分旺盛時，代謝產(chǎn)物堆積，CO2增多，營養(yǎng)液氫離子濃度升高，酚紅指示劑顏色變黃。如估計營養(yǎng)成分未耗盡，此時只需加入少許NaHCO3調(diào)節(jié)即可；如營養(yǎng)成分已枯竭，則需重新更換營養(yǎng)液。在使用自控CO2溫箱時培養(yǎng)瓶塞用無菌紗布棉塞，箱內(nèi)穩(wěn)定提供5% CO2，能保持培養(yǎng)液恒定pH值。

傳代培養(yǎng)：當細胞生長鋪滿瓶底，需進行傳代培養(yǎng)。細胞分裂增殖擴展連片，占滿器皿表面，這時需要對其分離，并重新培養(yǎng)，這一操作過程稱之為傳代。有80%～90%或剛剛?cè)繀R合的細胞，是傳代的理想時期。過早，細胞產(chǎn)量不足；過晚，致使細胞健康狀態(tài)不佳。因此，把握好時機很重要。另外，細胞對酶的消化作用反應(yīng)不一，有的敏感，有的遲鈍。根據(jù)細胞特點，適度掌握細胞消化時間和選擇適宜的方法很關(guān)鍵。處理得好，細胞損失少，細胞濃度均勻，細胞生長速度一致。

① 吸出培養(yǎng)瓶內(nèi)舊培養(yǎng)液；

② 加入胰蛋白酶和EDTA混合液蓋滿瓶底；

③ 作用2～5 min，檢查，如有細胞間隙變大，細胞質(zhì)回縮現(xiàn)象，終止消化；

④ 吸出消化液，加入Hanks液，輕輕轉(zhuǎn)動以免細胞流失，洗去殘留的消化液，如果單用胰蛋白酶，可直接加入培養(yǎng)液，免洗；

⑤ 用吸管輕輕吹打瓶壁，使細胞脫落制成懸液，記數(shù)后記錄其濃度；

⑥ 重新接種培養(yǎng)。

此法可大量培養(yǎng)細胞組織，特別適用于生物制品生產(chǎn)，但用于經(jīng)常性細胞培養(yǎng)研究則太繁瑣，易染菌。

5）組織塊單層細胞培養(yǎng)法

此法的特點在于把組織剪成更小的小塊（0.5～1 mm3大小），在不加任何粘著劑的情況下，由于組織體積很小，能直接附于瓶壁上，細胞自組織塊邊緣向外長出，最后連接成片形成單層細胞，從而簡化了原代單層細胞的培養(yǎng)過程。組織塊單層細胞培養(yǎng)法，是當前各培養(yǎng)室常用的初代培養(yǎng)法。