qPCR熒光定量是指在反應(yīng)體系中加入熒光基因，利用熒光信號積累實(shí)時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。

　　qPCR熒光定量技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCR相比，具有特異性更強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好、定量準(zhǔn)確、速度快、全封閉反應(yīng)、有效解決PCR污染問題、自動化程度高等特點(diǎn)，已成為*的核酸分子定量的標(biāo)準(zhǔn)方法，目前在基因表達(dá)研究和臨床疾病檢測等領(lǐng)域已得到廣泛應(yīng)用（如轉(zhuǎn)基因動植物檢測、RNAi基因失活率檢測、病原微生物或病毒含量檢測、基因差異表達(dá)、基因分型）。

AceQ Universal SYBR qPCR Master Mix

圖1.廣闊的定量閾

以HeLa 細(xì)胞cDNA 為稀釋液，將pUC19 質(zhì)粒進(jìn)行7 個10 倍梯度稀釋，第7 個稀釋梯度中質(zhì)?？截悢?shù)濃度約為7 copies/4 μl。使用AceQ® Universal 預(yù)混液對各稀釋梯度中的pUC19 質(zhì)粒進(jìn)行檢測，每孔模板使用量為4 μl?？梢钥吹剑珹ceQ®Universal預(yù)混液在寬廣的模板量區(qū)間內(nèi)具有線性關(guān)系，可輕松檢測出個位數(shù)拷貝的待測模板。

圖2.產(chǎn)品的特異性

對隨機(jī)選取的38 個體系進(jìn)行qPCR 檢測，驗(yàn)證AceQ® Universal預(yù)混液擴(kuò)增特異性。通過對融解曲線分析可知，38 個體系均無非特異性擴(kuò)增。說明AceQ® Universal 預(yù)混液擁有的特異性。

圖3.全平臺通用

使用AceQ® Universal 預(yù)混液在不同類型的qPCR 儀（機(jī)型：StepOnePlusTM、QuantStudioTM 3、LightCycler® 96）上擴(kuò)增GAPDH 基因，定量結(jié)果很好。說明AceQ® Universal 預(yù)混液儀器適用性廣，無需針對不同儀器調(diào)整ROX 濃度。

本產(chǎn)品是使用SYBR Green I 嵌合熒光法進(jìn)行qPCR的試劑，采用化學(xué)法修飾的熱啟動DNA聚合酶AceTaq® DNA Polymerase，配合針對qPCR優(yōu)化的適Buffer，可以有效抑制非特異擴(kuò)增，從而顯著提高擴(kuò)增效率，適用于進(jìn)行高靈敏度的qPCR反應(yīng)。本產(chǎn)品是一種含有qPCR反應(yīng)適濃度SYBR Green I的2 × 預(yù)混試劑，可以在寬廣的定量區(qū)域內(nèi)得到良好的標(biāo)準(zhǔn)曲線，對靶基因進(jìn)行準(zhǔn)確定量、檢測，重復(fù)性好，可信度高。另外，產(chǎn)品中含有特殊的ROX Passive Reference Dye，適應(yīng)于所有qPCR儀器，無需在不同儀器上調(diào)整ROX的濃度，只需在配制反應(yīng)體系時加入引物和模板即可進(jìn)行擴(kuò)增。

Q1：如何判斷CT值有效性？

A1：(1) 融解曲線單峰（染料法）

(2) 擴(kuò)增曲線指數(shù)擴(kuò)增區(qū)域，復(fù)孔間CT值STD<0.2

(3) 閾值設(shè)置合理

(4) NTC確認(rèn)無氣溶膠污染或可以忽略

(5) NRT確認(rèn)無基因組殘留污染或可以忽略

(6) 擴(kuò)增效率符合近似計算標(biāo)準(zhǔn)，標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)R2大于0.98，擴(kuò)增效率e介于95-105%或者90-120%之間。

Q2：常見的擴(kuò)增曲線異常有哪些，如何解決？

A2：(1) 擴(kuò)增曲線不光滑：信號太弱，經(jīng)系統(tǒng)矯正后產(chǎn)生。建議提高模板濃度重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

(2) 擴(kuò)增曲線斷裂或下滑：一般由于模板濃度較高，基線的終點(diǎn)值大于CT值。建議減小基線終點(diǎn)（CT值-4），重新分析數(shù)據(jù)。

(3) 個別擴(kuò)增曲線突然驟降：反應(yīng)管內(nèi)留有氣泡，由于溫度升高后氣泡破裂，使儀器檢測到的熒光值突然降低所致。建議反應(yīng)前要仔細(xì)檢查反應(yīng)管內(nèi)是否有氣泡殘留。

(4) 擴(kuò)增曲線呈鋸齒狀且不連續(xù)：ROX添加不當(dāng)。需校正參比染料。

Q3：標(biāo)準(zhǔn)曲線擴(kuò)增效率小于90%或者大于120%，線性關(guān)系不佳。

A3：(1) 加樣誤差。加大模板稀釋倍數(shù)，提高加樣體積。加大稀釋體積，使不同稀釋梯度的濃度更準(zhǔn)確。

(2) 標(biāo)準(zhǔn)品降解。重新制備標(biāo)準(zhǔn)品，重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

(3) 模板濃度過高。存在反應(yīng)抑制，增加模板稀釋倍數(shù)。

(4) 引物擴(kuò)增特異性不好。重新設(shè)計引物，重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

Q4：在定量時，如何判斷cDNA投入量。

A4：*得到的cDNA需要進(jìn)行多個梯度稀釋，將不同梯度稀釋的cDNA進(jìn)行qPCR定量，選取CT值落在18-28，或者15-33范圍內(nèi)的擴(kuò)增曲線對應(yīng)的cDNA 稀釋梯度作為后續(xù)該基因的參考稀釋度（CT值在18-28，或者15-33區(qū)間范圍被認(rèn)為是準(zhǔn)確的）。有一點(diǎn)需要注意，當(dāng)使用cDNA原液進(jìn)行檢測的時候，使用量不能超過 qPCR體系的1/10，因?yàn)閏DNA中包含很多抑制qPCR的組份，使用體積過大會導(dǎo)致擴(kuò)增失敗。

Q5：如何確定基因表達(dá)量高低。

A5：如果基因擴(kuò)增CT值超過30，使用PCR產(chǎn)物通過梯度稀釋創(chuàng)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，判斷該引物擴(kuò)增效率，若擴(kuò)增效率滿足90-120%，則可以判斷該基因擴(kuò)增CT值偏大是由于基因表達(dá)量低所致。

Q6：陰性對照出現(xiàn)明顯擴(kuò)增。

A6：(1) 反應(yīng)體系污染。更換新的Mix、水、引物重復(fù)實(shí)驗(yàn)。反應(yīng)體系在超凈工作臺內(nèi)配制，減少氣溶膠污染。

(2) 擴(kuò)增為引物二聚體引起。配合融解曲線進(jìn)行分析。

Q7：NRT出現(xiàn)明顯擴(kuò)增。

A7：NRT出現(xiàn)明顯擴(kuò)增，說明存在基因組污染，可通過實(shí)驗(yàn)組和NRT的CT值來判斷實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)是否可用。當(dāng)實(shí)驗(yàn)組CT值與NRT的CT值差值大于5，說明由gDNA導(dǎo)致的誤差小于5%，則可以忽略gDNA污染；若實(shí)驗(yàn)組與NRT的CT值差值小于3或者幾乎一致，則實(shí)驗(yàn)組擴(kuò)增產(chǎn)物的模板很大一部分來源于gDNA，這樣的實(shí)驗(yàn)組就失去定量意義，建議使用去基因組的RNA提取試劑盒進(jìn)行RNA提取，或者反轉(zhuǎn)錄時，加入去基因組步驟。

Q8：CT值出現(xiàn)太晚。

A8：(1) 擴(kuò)增效率極低。優(yōu)化反應(yīng)條件，嘗試三步法擴(kuò)增程序，或者重新設(shè)計合成引物。

(2) 模板濃度太低。減少稀釋度重復(fù)實(shí)驗(yàn)，一般未知濃度的樣品先從Zui高濃度做起。

(3) 模板降解。重新制備模板，重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

(4) PCR產(chǎn)物太長。推薦PCR產(chǎn)物長度為80 bp-150 bp。

(5) 體系中存在PCR抑制劑。一般為模板帶入，加大模板稀釋倍數(shù)或者重新制備模板重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

Q9：反應(yīng)結(jié)束無擴(kuò)增曲線出現(xiàn)。

A9：(1) 反應(yīng)循環(huán)數(shù)不夠。一般設(shè)置循環(huán)數(shù)為40，但需要注意的是過多的循環(huán)會增加過多的背景信號，降低數(shù)據(jù)可信度。

(2) 確認(rèn)程序中是否設(shè)置了信號采集步驟。兩部法擴(kuò)增程序一般將信號采集設(shè)置在退火延伸階段；三步法擴(kuò)增程序應(yīng)當(dāng)將信號采集設(shè)置在72℃延伸階段。

(3) 確認(rèn)引物是否降解。長時間未使用的引物應(yīng)先通過PAGE電泳檢測完整性，以排除引物降解的可能性。

(4) 模板濃度太低。減少稀釋度重復(fù)實(shí)驗(yàn)，一般未知濃度的樣品先從Zui高濃度做起。

(5) 模板降解。重新制備模板，重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

Q10：融解曲線出現(xiàn)多峰。

A10：(1) 引物設(shè)計不優(yōu)。根據(jù)qPCR設(shè)計原則設(shè)計、合成新的引物。

(2) 引物濃度太高。適當(dāng)降低引物濃度。

(3) cDNA模板帶有基因組污染。重新制備cDNA模板。

Q11：實(shí)驗(yàn)重復(fù)性差。

A11：(1) 加樣體積失準(zhǔn)。使用準(zhǔn)確度較好的移液槍，擴(kuò)大反應(yīng)體積，將模板做高倍稀釋，以大體積加入反應(yīng)體系中。

(2) 定量PCR儀不同位置溫度控制不一致。定期校準(zhǔn)儀器。

(3) 模板濃度太低。模板濃度越稀，重復(fù)性越差，減少模板稀釋度或提高加樣體積。

(4) 做4-6個復(fù)孔，刪除其中重復(fù)性不好的孔，將剩余的進(jìn)行后續(xù)計算。

Q12：高GC含量的模板，建議用什么產(chǎn)品進(jìn)行定量？

A12：建議用Q111進(jìn)行定量。

Q13：如果內(nèi)參CT值很低，目標(biāo)基因CT值很高，該如何稀釋樣品？

A13：可以在定量內(nèi)參的時候?qū)⒛０逑♂?，而定量目的基因時模板不稀釋，結(jié)果仍舊采用 2-ΔΔCT進(jìn)行計算，CT值減兩次，稀釋倍數(shù)會被相應(yīng)減掉，但要保證不同樣品在檢測同一基因時稀釋倍數(shù)要一致。

Q14：如何預(yù)防氣溶膠污染？

A14：在加樣的時候要小心操作，盡量在超凈工作臺中進(jìn)行加樣，并注意通風(fēng)。擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，盡量不要打開產(chǎn)物的管蓋，不要跑膠，跑完后需要妥善處理。如果氣溶膠污染情況很嚴(yán)重，建議采用通風(fēng)結(jié)合含強(qiáng)氧化劑的消毒液進(jìn)行處理。

Q15：相對定量為什么要做標(biāo)準(zhǔn)曲線？

A15：相對定量分析中采用2-ΔΔCT公式進(jìn)行計算比較不同樣品中基因的表達(dá)量時，前提是該體系的擴(kuò)增效率e是盡可能接100%的。相對定量中做標(biāo)準(zhǔn)曲線的目的就是為了判斷該擴(kuò)增體系中的擴(kuò)增效率e是否是接近100%，能否用2-ΔΔCT公式進(jìn)行計算；如果擴(kuò)增效率e與100%相差很大，在比較基因表達(dá)差異時是需要帶入實(shí)際的擴(kuò)增效率進(jìn)行計算的。

Q16：怎么做定量？

A16：首先需要有一個已知拷貝數(shù)濃度的樣品作為標(biāo)準(zhǔn)品，將其稀釋至少5個梯度后和待測樣品同時上機(jī)進(jìn)行定量檢測，以標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)的Log值為橫坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)品的CT值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，將檢測獲得的待測樣品的CT值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程中就能求得待測樣品的拷貝數(shù)濃度。

Q17：模板的稀釋液選擇。

A17：稀釋模板可以使用購買的Nuclease-free water、DEPC水或者實(shí)驗(yàn)室自備的ddH2O等。TE里有EDTA會抑制酶的活性，不可作為稀釋液。